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써던블롯팅 원리분석 실험보고서
1.원리
써던 블롯팅은 1975년 써던(southern)에 의하여 고안된 유전자 연구기법이기 때문에 그렇게 명명하였다. 사람의 유전자를 제한요소로 절단하면 여러 크기의 dna절편이 생긴다
다양한 절편을 전기영동하면 절편의 크기에 따라 분리된다. 한천 겔에 있는 dna를 흡착지로 이전하면, 한천 겔에 있는 위치와 정확하게 일치하는 곳에 dna절편이 있게 된다
겔에서 흡착지로 이전시키는 기법이 포함되기 때문에 써던 이전을 동의어로 사용한다. 흡착지에 있는 분절은 크기에 따라 약 300만개 정도가 있기 때문에 이 중에서 원하는 한 가지의 분절을 찾아낸다는 것이 간단한 일은 아니다
여기에 찾고자 하는 dna의 전부 혹은 일부분을 가지고 있다면 이것을 찾고자 하는 dna의 소식자로 사용하여 흡착지 위의 dna와 소식자 사이의 보합되는 위치에 결합되는 dna-dna 보합결합의 기법을 이용하여 원하는 dna분절의 유무를 확인할 수 있다.
써던 블롯팅을 응용함에 있어 제한효소 분절길이의 다형성(rflp)을 이해하는 것이 필수적이다.rflp의 원리는 dna를 제한효소로 절단시키면, 절단된 유전자 길이는 개인간에 다양하다는 원리를 이용한 유전자 분석법이다.
2.방법
제일 먼저해야 할 dna추출은 말초혈액 백혈구로 부터 얻는 방법이 용이하고 대량 얻을 수 있다. 얻어진 dna를 유전자 제한효소로 소화시킨 다음 한천 겔 전기영동을 하면 절단 유전자의 길이에 따라 분리된다
겔 내에서의 이동거리는 dna의 분자량에 반비례한다. 전기영동이 끝나면 겔에 있는 dna를 흡착지에 전이시켜야 한다
겔에 있는 모든 dna가 흡착지로 이전되었기 때문에 소식자와 dna보합결합을 용이하게 할 수 있다. 흡착지에 있는 절단 유전자 수는 수 십만에서 수 백만에 이르기 때문에 원하는 유전자를 찾기 위해 소식자의 도움이 필요하다
우선 유전자에 표지를 하여야 하는데, 32p가 많이사용된다. 흡착지의 dna와 소식자 사이의 보합결합을 위하여, 적당한 크기의 비닐주머니에 흡착지, 반응액과 표지소식자를 넣어 사방을 봉한 다음 적당한 온도에서 반응시킨다
흡착지-소식자 결합위치와 상응하는 곳에 x-선 필름이 감광되기 때문에, 찾고 싶은 dna띠의 숫자 및 분자량을 확인할 수 있다.
3.용도
써던 이전은 지놈 dna의 분절의 확인에 널리 이용되고 있으며 플라즈미드, 코스미드, 박테리오 파아지 등의 dna를 확인하는 데도 널리 이용되는 유전자 조작 기법이다. 써던 이전법을 지놈 dna의 분절을 확인하는데 이용될 때는 rflp라는 용어를 흔히 사용한다
써던 블롯팅의 임상적 이용은 다음과 같은 예를 들 수 있다.
1) 유전질환의 진단
써던 블롯팅을 이용하여 dna진단이 가능한 질환으로는 혈우병, 페닐케톤뇨증, 다낭성신장, 선천성부신증식증 등이 있다.
2) hla 항원의 결정 (이하 생략)
